Лекция 12. Репликация. Принципы. Синтез ДНК in vitro

Доказательство полуконсервативного характера репликации

Для выяснения вопроса о характере расхождения цепей по дочерним молекулам Мэтт Мезельсон и Фрэнк Сталь в 1958г. разработали метод равновесного центрифугирования в градиенте плотности CsCl. .

ДНК разделяется не по молекулярным весам, а по удельной плотности.

E. сoli выращивали на протяжении нескольких поколений на среде, содержащей тяжелый изотоп азота (N₁₅), для того, чтобы вся ДНК была "тяжелой". Перед очередным раундом деления клетки синхронизировали. При этом в среде заменяли N₁₅ на легкий изотоп N₁₄ с тем, чтобы вновь синтезированные цепи были "легкими". После репликации ДНК выделяли и центрифугировали в градиенте плотности CsCl.

Полуконсервативность означает, что каждая дочерняя ДНК состоит из одной матричной цепи и одной вновь синтезированной.

Равное распределение "тяжелых" и "легких" цепей между всеми молекулами исключало возможность консервативного способа, согласно которому одна дочерняя клетка получает материнскую ДНК, а другая - вновь синтезированную, обе цепи которой являются новыми.

Клетки второго поколения содержали как полностью "легкие" молекулы, так и "гибридные", состоящие из одной "легкой" и одной "тяжелой" цепи, аналогичные молекулам первого поколения. Этот факт исключал возможность дисперсного механизма, согластно которому куски материнской ДНК случайным образом распределяются между дочерними молекулами.