Лекция 13. Схемы репликации ДНК in vivo
|
Лекция 13. Схемы репликации ДНК in vivo |
|
| Список рисунков |
Схема прерывистой антипараллельной репликации Рейджи Оказаки
1968 г.
Исходные посылки: все данные Корнберга, полученные в ферментативной системе in vitro, и "картинки" Кэрнса верны ( но картинки неправильно интерпретированы).
Оказаки специально разработал два новых метода исследования.
1. Метод импульсного мечения.
До Оказаки метку давали в культуральную среду и быстро начинали отмывать клетки,
но минимальное время подачи метки было 5 мин. Оказаки через нужный момент времени
после добавления меченого тимидина давал 1000-кратный избыток холодного (немеченого)
тимидина. Таким образом, метка включается только в течение очень короткого времени.
Оказаки считал, что время Кэрнса (5 мин.) очень велико для получения истинной картины происходящего при репликации.
2. Центрифугирование в щелочном градиенте сахарозы.
Сахароза разводится на щелочи. В щелочной среде происходит денатурация ДНК.
В этом случае короткие фрагменты ДНК, если они есть, отделяются от длинных.
После этого их можно выявить при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы,
разделяющем молекулы по молекулярному весу.
Оказаки предположил, что синтез ДНК идет короткими фрагментами и что короткие фрагменты должны сшиваться.
Сшиваются они лигазой. ДНК-лигаза была обнаружена как у прокариот, так и у эукариот. У E. сoli были найдены мутанты по лигазе.
Оказаки провел эксперимент на бактериях, зараженных фагом Т4,
у которого есть своя термочувствительная лигаза, которая работает при 20
С
и не работает при 43С.
Если в клетку попадает фаговая ДНК, то клетка переключается на репликацию ДНК
фага.
Клетки заражали фагом Т4, давали импульсную метку Н3-тимидин
и выращивали при двух температурах: 20С
и 43С.
Потом проводили центрифугирование в щелочном градиенте сахарозы.
 |
|
Лигаза E. coli нуждается в коферменте НАД, а лигаза фага - в АТФ. Если E.coli не давать никотиновую кислоту (предшественник НАД), бактериальная ДНК реплицируется, но не сшивается.
Прерывистость репликации показана для всех объектов, кроме фагов, содержащих одноцепочечную ДНК.
У некоторых фагов и вирусов прерывистый синтез идет по обеим цепям. У бактерий и высших организмов одна цепь образуется непрерывно, а другая - прерывисто (лидирующая и запаздывающая цепи).
 |
Размер фрагментов Оказаки видоспецифичен и составляет для фагов 1000-2000 нукл., E. сoli - 1000 нукл., для эукариот - 200-400 нукл.
 |
У фага Т7 обе цепи ДНК тоже реплицируются прерывисто. Они имеют разную плотность (в одной больше пуринов). Цепи были разделены в градиенте плотности CsCl и помещены на две колонки. Была осуществлена ковалентная привязка, поэтому они не могли сойти со смолы. Потом провели репликацию в условиях импульсного мечения. Пропустили все фрагменты через первую колонку. Выход был 50%. Остальные прогнали через вторую колонку. Выхода не было. Таким образом, было показано, что фрагменты комплементарны обеим матричным цепям. Значит, фрагменты образуются по обеим цепям |
| Список рисунков |